توضیحات
چکیده
زمینه: عوامل رشد فیبروبلاست (FGF) و گیرنده های آنها (FGFR) نقش اساسی در سلول ایفا می کنند.عدم تنظیم در مسیرهای سیگنالینگ FGF / FGFRبا بسیاری از ناهنجاری ها و گسترش سرطان همراه است.از این گروهگیرنده فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع دو در مسیر پیامرسانی سلولی و تنظیم فرآیندهای مهم زیستی از جمله تمایز و تکثیر سلولی نقش اساسی دارد. اختلال در انتقال پیام این گیرنده با چندین اختلال پاتولوژیکی انسانی مرتبط می باشد. در این میان مسمومیت با فلزات سمی نیز یکی از مشکلات عمده در زیست شناسی سلولی است که اثرات آنها بر مسیرهای مختلف سیگنالینگ به اثبات رسیده است.
هدف: این مطالعه به منظور تخلیص ناحیه کینازی FGFR2b و بررسی اثر فلزات سمی سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بر ساختار ناحیه کینازی رسپتور فاکتور رشد فیبروبلاستی نوع دو انجام شد.
مواد و روشها: در این مطالعه تجربی پروتئین نوترکیب با استفاده از پلاسمیدpLEICS-01 ، باکتری BL21، القائ IPTG ، الکتروفورز و ستون حاوی Ni2+ -NTA بیان و خالص شد. فعال بودن نمونه پروتئین بعد از دیالیز توسط تعامل با ناحیه SH2 فسفولیپاز(PLC)C طبیعی و موتان توسط روش PAGE بررسی شد. طیف فلوئورسانس، CD, FTIR و دناتوراسیون شیمیایی پروتئین خالص شده در حضور غلظت های مختلف سرب، کادمیوم، نیکل و آلومینیوم بررسی و ارزیابی گردید.
یافتهها: بررسی SDS-PAGE قبل و بعد از القا شدن نشان داد که پروتئین بیان شده در دمای ۲۰ درجه سانتی گراد محلول است. نتایج PAGE فعال بودن پروتئین خالص شده را تأیید کرد. بررسی طیف سنجی فلوئورسانس کاهش شدت نشر را با افزایش تدریجی غلظت هر چهار فلز سمی نشان داد. طیف CD نشان داد ناحیه ی کینازی مورد مطالعه ما دارای ترکیب بتای بیشتری نسبت به آلفا می باشد و نیز حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم در محلول، ساختار دوم کیناز را تغییر نمی دهد، ولی سرب قادر به تغییر این ساختار می باشد. آزمایش انجام شده توسط FTIR نیز اثر سرب را تایید کرد. دناتوراسیون شیمیایی ساختار سوم در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم ناحیه کینازی را تغییر نداد. ولی این تغییر در حضور سرب مشاهده شد.
بحث و نتیجه گیری: باتوجه به یافته ها، ناحیه کینازی گیرنده نوترکیب عامل رشد فیبروبلاستی ۲b که یک پروتئین ۳۸ کیلودالتونی است تولید و خالص گردید و نشان داده شد که به صورت محلول و فعال است. تغییرات ساختار سوم و دوم ناحیه کینازی موجب ناپایدار شدن آن در حضور سرب گردید. این ناپایداری در سطح مولکولی می تواند موجب اختلال در مسیر پیام رسانی سلول شود. گرچه این ناپایداری در حضور کادمیوم، نیکل و آلومینیوم مشاهده نشد.
کلیدواژه ها: گیرنده فاکتور رشد فیبروبلاستی، ناحیه کینازی، سیگنالینگ، فلزات سمی، طیف سنجی فلوئورسانس،CD، FTIR
فهرست مطالب
فصل اول مقدمه و اهمیت موضوع 3
1-1- مقدمه 4
1-1-1- فاکتور رشد فیبروبلاستی 4
1-1-2- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست 4
1-1-3- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاست نوع ۲ 5
1-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی تیروزین کینازی 6
1-1-5- فعال سازی کینازها از طریق ایجاد موتاسیون 8
1-2- اهمیت موضوع وضرورت انجام تحقیق 9
1-3- اهداف طرح 9
1-3-1- هدف اصلی 9
1-3-2- اهداف فرعی 9
1-3-3- اهداف کاربردی 10
1-3-4- فرضیات 10
1-3-5- متغییرها 10
فصل دوم مروری بر متون گذشته 11
2-1- پروتئین 12
2-1-1- ساختمان پروتئین ها 13
2-1-2- گیرنده های تیروزین کینازی 17
2-1-3- فاکتورهای رشد فیبروبلاستی 18
2-1-4- گیرنده های فاکتور رشد فیبروبلاستی 20
2-1-5- گیرنده های فاکتورهای رشد فیبروبلاستی و اختلالات پاتولوژیکی 22
2-1-6- مسیر پیام رسانی سلولی فاکتورهای رشد فیبروبلاستی 25
2-1-7- تنظیم مسیر پیام رسانی فاکتور های رشد فیبروبلاستی 29
2-2- فلز چیست؟ 31
2-2-1- فلزات سمی 31
2-2-3- سرب 32
2-2-4-کادمیوم 32
2-2-5- نیکل 33
2-2-6-آلومینیوم 33
2-7- تاثیر فلزات بر مسیرهای سیگنالینگ 34
2-7-1-ROS 34
2-7-2- MAPK 35
2-7-3- PI3K/Akt 36
2-7-4- HIF 37
2-7-5- NF-kB 38
2-7-6- NFAT 39
2-7-7- AP 40
2-8- اثر ترکیبات فلزی بر مسیرهای سیگنالینگ و بیان ژن 41
2-8-1- سرب 41
2-8-2- کادمیوم 43
2-8-3- نیکل 46
2-8-4- آلومینیوم 48
2-9- پیشگویی ساختمان پروتئین ها 50
2-9-1- بررسی ساختار پروتئین ها 50
2-9-2- مطالعه ی ساختاری پروتئین ها 51
2-9-3- تکنیک های مطالعه ی ساختار پروتئین ها 52
2-9-4- تکنیک فلوئورسانس اسپکتروسکوپی 53
2-9-5- تکنیک دورنگ نمایی حلقوی(CD) 56
2-9-6- تکنیک ها و عوامل دناتوراسیون 57
2-10- تکنیک های تولید و تخلیص پروتئین های نوترکیب 60
2-10-1- کاربرد پروتئین های نوترکیب 60
2-10-2- پروتئین های نوترکیب (Recombinant proteins ) 60
2-10-3- تولید پروتئین های نوترکیب در گیاهان 63
2-10-4- استفاده ازایشریشیاکلی به عنوان یک ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین 64
2-10-5- خالص سازی پروتئین های نوترکیب 64
فصل سوم مواد و روش ها 66
3-1- مواد، تجهیزات و متغیر ها ی آزمایش 67
3-1-1- مواد مورد استفاده در آزمایش 67
3-1-2- دستگاه ها و تجهزات مورد استفاده در آزمایش 68
3-2- محلول ها و بافرها 69
3-2-1- تهیه ی استوک آمپی سیلین 69
3-2-2- تهیه ی استوک IPTG 70
3-2-3- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت بررسی حلالیت پروتئین 70
3-2-4- تهیه ی بافر لیز کننده سلول جهت تخلیص پروتئین 70
3-2-5- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید ۴% 70
3-2-6- تهیه ی محلول ژل پلی آکریل آمید ۱۲% 71
3-2-7- تهیه ی محلول APS10% 71
3-2-8- تهیه ی بافر الکترود x10 (Running buffer) 71
3-2-9- تهیه ی بافر نمونه Sample Buffer)) 71
3-2-10- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/0 مولار 72
3-2-11- تهیه ی محلول Tris-Hcl 5/1 مولار 72
3-2-12- تهیه ی Staining Buffer 72
3-2-13- تهیه ی Destaining Buffer 73
3-2-14- تهیه ی محلول آکریل آمید- بیس آکریل آمید 73
3-2-15- تهیه بافر SDS 73
3-2-16- تهیه بافرA (Washing Buffer) 73
3-2-17- تهیه بافر B ( (Eluting Buffer 74
3-2-18- تهیه بافر دیالیز 74
3-2-19- تهیه استوک گوانیدین هیدروکلراید (GnHCl) 74
3-2-20- تهیه استوک فلزات 74
3-2-21- آماده سازی محیط های کشت باکتری 74
3-3- روش انجام کار 75
3-3-1- نمایش ساختار پلاسمید نوترکیب pLEICS-01 و توالی ژنی ناحیه تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 75
3-3-2- مراحل تولید پروتئین نوترکیب 77
3-3-3- تعیین غلظت پروتئین 83
3-3-4- مطالعات اسپکتروسکوپی فلوئورسانس 83
3-3-5- مطالعات اسپکتروسکوپی دورنگ نمایی حلقوی CD)) 85
3-3-6- مطالعات اسپکتروسکوپی FTIR 86
3-3-7- مطالعات دناتوراسیون شیمیایی با استفاده از اسپکتروسکوپی فلوئورسانس 87
فصل چهارم یافته ها و نتایج 88
4-1- بررسی بیان پروتئین در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد 88
4-2- بررسی بیان پروتئین در دمای۲۰ درجه سانتی گراد 89
4-3- بررسی حلالیت پروتئین بیان شده دردو دمای۲۰ و ۳۷ درجه سانتی گراد 90
4-4- بررسی میزان خلوص پروتئین محلول شده 91
4-5- آنالیز SDS-PAGE بعد از دیالیز 92
4-6- بررسی عملکرد پروتئین خالص شده 93
4-7- بررسی ساختار سوم ناحیهی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 94
4-8- بررسی اثر دناتوراسیون شیمیایی بر طول موج ماکزیمم نشر فلوئورسنس ذاتی ناحیهی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 98
4-9- بررسی اثردناتوراسیون شیمیایی بر شدت نشر فلوئورسانس ذاتی ناحیه ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 101
4-10- بررسی اثر سرب، کادمیوم، آلومینیوم و نیکل، بر روی ساختار دوم ناحیه ی تیروزین کینازی پروتئین نوترکیب FGFR2b 104
فصل پنجم بحث و نتیجه گیری 109
5-1- بحث و نتیجه گیری 110
فهرست منابع: 116
….………………………………………………………………………………..Abstract125
دیدگاهها
هیچ دیدگاهی برای این محصول نوشته نشده است.