بررسی باکتری سالمونلا تیفی در سالاد به وسیله روش LAMP-PCR

توضیحات

چکیده
سالمونلا باکتری گرم منفی، متحرک و باسیلی شکل است که خصوصیات عمومی خانواده انتروباکتریاسه را دارا می‌باشد. سالمونلا و سروتیپ‌های آن منبع مهم آلودگی غذاهای انسانی و عامل پاتوژن بسیار قوی و بیماری زا در انسان هاست. امروزه بیش از ۲۴۵۰ سروتیپ سالمونلا شناسایی شده است که برخی از این سروتیپ‌ها عامل بیماری‌هایی از قبیل تب تیفوئید و انتروکولیک در انسان می‌باشند. بیماری های ناشی از این عامل یک معضل بزرگ بهداشتی در جهان به خصوص در کشورهای در حال توسعه از جمله کشور ما می باشد. بنابراین تشخیص سریع، دقیق و به موقع آن برای جلوگیری از اپیدمی و عوارض مخرب این باکتری ضروری به نظر می رسد.
روش های مختلفی برای جداسازی باکتری سالمونلا از نمونه‌های محیطی وجود دارد که شامل: روش‌های کشت سنتی و بیوشیمیایی، سرولوژیکی و مولکولی (از جمله PCR) است. تمام این روش ها به زمان طولانی، تعداد زیاد باکتری در نمونه اولیه، تجهیزات گران قیمت آزمایشگاهی و به افراد متخصص در این زمینه نیاز دارند.
هدف از این مطالعه بررسی کارایی روش نوین تشخیص مولکولی LAMP در تشخیص عامل عفونی سالمونلا تیفی می باشد. بررسی نتایج در تشخیص مولکولی سالمونلاها نشان داد که روش LAMP روشی سریع، ارزان و اختصاصی است و به جای دستگاه های گران قیمت PCR و برنامه چرخه حرارتی چند دمایی آن با استفاده از یک بلوک حرارتی بسیار ساده و ارزان و در یک دمای واحد ۶۰ درجه سانتی گراد و همچنین مشاهده کدورت حاصل از فرایند تکثیر ژن ها در زمان کوتاه تری به تشخیص اختصاصی این باکتری سالمونلا پرداخت.
این روش می تواند جهت تشخیص مولکولی سریع، دقیق و ارزان با کاربرد گسترده در آزمایشگاه های تشخیصی و بخصوص تشخیص عوامل عفونی در آزمایشگاه های مناطق محروم و آزمایشگاه های سیار مورد استفاده قرار گیرد.
واژه های کلیدی : سالمونلا، تشخیص مولکولی، PCR، LAMP

فهرست مطالب

         عنوان                                                                                                                   صفحه    

         چکیدۀ فارسی …………………………………………………………………………………………………………………………….۱۲

فصل اول: مقدمه (اهداف تحقیق) ………………………………………………………………………………………………….۱۳

اهداف تحقیق در نگاه اجمالی………………………………………………………………………………………………………..۱۶

فصل دوم: کلیات (سابقه و پیشینۀ تحقیق)…………………….……………………………………………………………….۱۷

۱-۲- مشخصات جنس سالمونلا……………………………………………………………………………………………………۱۸

۱-۱-۲- تاریخچه…………………….………………………………………………………………………………………………..۱۸

۲-۱-۲- خواص شکلی…………………….………………………………………………………………………………………. ۱۹

۳-۱-۲- خواص بیوشیمیایی…………………….………………………………………………………………………………….۱۹

۴-۱-۲-مقاومت در برابرعوامل فیزیکیوشیمیایی…………………………………………………………………………..۲۰

۵-۱-۲- خواصکشت…………………………………………………………………………………………………………………۲۰

۶-۱-۲ شرایط رشد سالمونلاها……………………………………………………………………………………………………..۲۱

۷-۱-۲- بقا سالمونلا……………………………………………………………………………………………………………………۲۲

۸-۱-۲- زیستگاه…………………………………………………………………………………………………………………………۲۳

۲-۲- تاکسونومی…………………………………………………………………………………………………………………………۲۳

۱-۲-۲- سالمونلا تیفی…………………………………………………………………………………………………………………۲۶

۲-۲-۲- سالمونلا انتریتیدیس………………………………………………………………………………………………………..۲۶

۳-۲-۲- سالمونلا کلراسوئیس……………………………………………………………………………………………………….۲۷

۴-۲-۲- سالمونلا پولوروم…………………………………………………………………………………………………………….۲۸

۵-۲-۲– سالمونلا گالیناروم…………………………………………………………………………………………………………..۲۸

۶-۲-۲- سالمونلا آریزونا……………………………………………………………………………………………………………..۲۹

۷-۲-۲-ساختمان آنتی­ژنی………………………………………………………………………………………………………….۳۱

۸-۲-۲- طبقه بندی سالمونلابه منظور اهداف اپیدمیولوژیکی………………………………………………………….۳۲

۱-۸-۲-۲- ارگانیسم­های موجب عفونت در انسان………………………………………………………………………..۳۲

۲-۸-۲-۲- واریته های سرولوژیکی سازگار با میزبان………………………………………………………………………۳۲

۳-۸-۲-۲- واریته های سرولوژیکی ناسازگار…………………………………………………………………………………۳۳

۳-۲- شاخص­های بیماری­زایی……………………………………………………………………………………………………..۳۳

۱-۳-۲-آنتی­ژن­های سطحی………………………………………………………………………………………………………..۳۳

۲-۳-۲-تهاجم…………………………………………………………………………………………………………………………….۳۳

۳-۳-۲-اندو­توکسین انترو­توکسین سیتو­توکسین …………………………………………………………………………….۳۴

۴-۲- بیماری­زایی و مکانیسم آن……………………………………………………………………………………………………۳۴

۱-۴-۲- روند بیماری­زایی……………………………………………………………………………………………………………۳۵

۲-۴-۲- میزان شیوع سالمونلوز در انسان……………………………………………………………………………………….۳۵

۳-۴-۲- عفونت­های سالمونلایی در انسان……………………………………………………………………………………..۳۶

۱-۳-۴-۲- تب تیفوئید و تب­های روده­ای……………………………………………………………………………………..۳۶

۲-۳-۴-۲- سپتی­سمی…………………………………………………………………………………………………………………۳۷

۳-۳-۴-۲- گاسترو­انتریت…………………………………………………………………………………………………………….۳۷

۴-۴-۲- علائم بالینی در انسان……………………………………………………………………………………………………..۳۷

۵-۲- اپیدمیولوژی……………………………………………………………………………………………………………………….۳۸

۶-۲- روش­های تشخیص…………………………………………………………………………………………………………….۴۰

۱-۶-۲- روش­های فنوتیپی…………………………………………………………………………………………………………..۴۱

۱-۱-۶-۲- بیوتایپینگ………………………………………………………………………………………………………………..۴۱

۲-۱-۶-۲- سروتایپینگ……………………………………………………………………………………………………………….۴۲

۳-۱-۶-۲- روش­های ایمنولوژیک………………………………………………………………………………………………..۴۲

۱-۳-۱-۶-۲- الایزا…………………………………………………………………………………………………………………….۴۳

۲-۳-۱-۶-۲-IMS…………………………………………………………………………………………………………………..44

۲-۶-۲- روش­های ژنوتیپی………………………………………………………………………………………………………….۴۴

۱-۲-۶-۲- روش واکنش زنجیره ایی پلیمرازPCR)) …………………………………………………………………. 45

۲-۲-۶-۲-multiplex PCR……………………………………………………………………………………………………47

۳-۲-۶-۲-real-time PCR……………………………………………………………………………………………..47

۴-۲-۶-۲- روش تکثیر هم دمای وابسته به حلقه LAMP………………………………………………………………48

۱-۴-۲-۶-۲- پرایمرهای LAMP………………………………………………………………………………………………..49

۲-۴-۲-۶-۲- مکانیسم واکنش LAMP……………………………………………………………………………………….51

۳-۴-۲-۶-۲-مشخصات روش LAMP………………………………………………………………………………………56

۴-۴-۲-۶-۲- مواد لازم برای انجام واکنش LAMP………………………………………………………………………57

۵-۴-۲-۶-۲- ارزیابی محصولات LAMP……………………………………………………………………………………60

۶-۴-۲-۶-۲- مکانیسم تشکیل کدورت در واکنش LAMP…………………………………………………………….61

۷-۴-۲-۶-۲- مزایای روش LAMP…………………………………………………………………………………………….62

۷-۲ مطالعات آزمایشگاهی…………………………………………………………………………………………………………….۶۳

۱-۷-۲- مطالعه بر روی سویه­ های سالمونلا به روش الایزا……………………………………………………………….۶۳

۲-۷-۲- مطالعه بر روی سویه­ های سالمونلا به روش PCR………………………………………………………………65

۳-۷-۲- مطالعه بر روی سویه­ های سالمونلا به روش LAMP…………………………………………………………..70

فصل سوم (مواد و روش ها)…………………………………………………………………………………………………………۷۵

۱-۳ وسایل مورد استفاده………………………………………………………………………………………………………………۷۶

۲-۳- مواد مورد استفاده ………………………………………………………………………………………………………………۷۷

۳-۳- رنگ آمیزی گرم………………………………………………………………………………………………………………..۷۹

۴-۳- تستهای بیوشیمیایی……………………………………………………………………………………………………………۷۹

۱-۴-۳- تست سیمون سیترات…………………………………………………………………………………………………….۸۱

۲-۴-۳- تست تریپل شوگر ایرون آگار(TSI) ………………………………………………………………………………81

۳-۴-۳- تست SIM…………………………………………………………………………………………………………………82

۴-۴-۳- تست اوره …………………………………………………………………………………………………………………..۸۲

۵-۳-روش تهیۀ گلسیرول استوک از باکتری­ مورد نظر…………………………………………………………………..۸۳

۶-۳-روش استخراج DNA……………………………………………………………………………………………………..83

۱-۶-۳-طرز تهیۀ محلول­های مورد نیاز برای استخراج DNA………………………………………………………..84

۲-۶-۳- مراحل استخراجDNA…………………………………………………………………………………………………84

۷-۳-تعیین غلظت DNA با دستگاه اسپکتروفتومتر……………………………………………………………………….۸۶

۸-۳- الکتروفورز………………………………………………………………………………………………………………………..۸۷

۱-۸-۳- طرز تهیه ژل آگارز…………………………………………………………………………………………………………۸۸

۲-۸-۳- طرز تهیۀ بافر (۱X)TBE……………………………………………………………………………………………….88

۹-۳- واکنش PCR……………………………………………………………………………………………………………………89

۱-۹-۳– اجزا واکنشPCR………………………………………………………………………………………………………….91

۲-۹-۳-روش انجام واکنش PCR با آنزیم SmarTaq DNA Polymerase……………………………….93

۱۰-۳- واکنش LAMP………………………………………………………………………………………………………………94

۱-۱۰-۳- روش انجام واکنشLAMP…………………………………………………………………………………………95

۱۱-۳- آلوده سازی سس مایونز با باکتری مورد نظر………………………………………………………………………..۹۶

۱۲-۳- آلوده سازی سالاد سبزیجات با باکتری مورد نظر…………………………………………………………………..۹۷

۱۳-۳- تهیه پورپلیت و شمارش باکتری­ها………………………………………………………………………………………۹۸

۱-۱۳-۳ تهیه رقت……………………………………………………………………………………………………………………..۹۸

۲-۱۴-۳– کشت سطحی………………………………………………………………………………………………………………۹۹

۲-۱۴-۳– کشت پورپلیت…………………………………………………………………………………………………………….۹۹

۳-۱۳-۳شمارش باکتری­ها…………………………………………………………………………………………………………..۹۹

فصل چهارم (نتایج)……………………………………………………………………………………………………………………۱۰۰

۱-۴- رنگ آمیزی گرم از باکتری……………………………………………………………………………………………….۱۰۱

۲-۴- نتایج کشت نمونه ها روی محیط اختصاصی shigella– salmonella agar………………………101

۲-۴- تست­های بیوشیمیایی……………………………………………………………………………………………………..۱۰۲

۱-۳-۴- تست اوره………………………………………………………………………………………………………………….۱۰۲

۲-۳-۴- تست سیمون سیترات…………………………………………………………………………………………………..۱۰۳

۳-۳-۴ تست TSI……………………………………………………………………………………………………………………104

۴-۳-۴ تست SIM……………………………………………………………………………………………………………………105

۵-۳-۴ تست متیل رد ……………………………………………………………………………………………………………….۱۰۶

۴-۴- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………………….107

۵-۴- PCR………………………………………………………………………………………………………………………………108

۱-۵-۴- حد تشخیص PCR………………………………………………………………………………………………………109

۶-۴- LAMP……………………………………………………………………………………………………………………….110

۱-۶-۴ حد تشخیص LAMP………………………………………………………………………………………………….112

فصل پنجم (بحث)……………………………………………………………………………………………………………………۱۱۳

نتیجه ­گیری………………………………………………………………………………………………………………………………..۱۲۱

منابع و ماخذ……………………………………………………………………………………………………………………………..۱۲۲